研究人員對抗原修復(fù)存在的問題和克服方法的討論

高溫抗原修復(fù)因其機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，對某些存在的問題不可能用設(shè)計(jì)對照的方法加以解決。有些抗體在冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好地顯示。對某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)過修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)，例如p185、Bcl—2、P-gp和nm23；而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)過修復(fù)會出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，例如p53、PCNA、ki-67和細(xì)胞周期素等。因此在使用該方法時(shí)一定小心，對結(jié)果的判斷也要客觀地作出分析。

某些商品化抗體因自身抗體質(zhì)量的問題，在石蠟切片上無論用什么方法，抗原怎么修復(fù)都無法顯示陽件結(jié)果；還有些抗體在陽性對照切片上有陽性結(jié)果，或文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)該有陽性結(jié)果，或從瑪論上講應(yīng)該會有陽性結(jié)果，但檢測結(jié)果為陰性結(jié)果。這導(dǎo)致操作者或研究者在抗原修復(fù)方式上和抗原修復(fù)介質(zhì)上進(jìn)行多種嘗試，力圖使該抗原出現(xiàn)在某些部位，結(jié)果可能仍然為陰性結(jié)果、或陽性很微弱、或假陽性結(jié)果（定位不準(zhǔn)確，一片淡染陽性結(jié)果）。出現(xiàn)上述現(xiàn)象首先應(yīng)該與廠商，或更換抗體或退貨，否則其結(jié)果是不可靠的，其次應(yīng)從組織的固定和方法的選擇上再認(rèn)真查找原因。

在20世紀(jì)的60年代一80年代，人們在利用生物素—親和素（抗生物）組成的親和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)以來，已發(fā)現(xiàn)在正常的哺乳類動物和人體細(xì)胞內(nèi)存在內(nèi)源性生物素，以肝、腎、乳腺和脂肪組織內(nèi)含量較高，但在人體的皮膚、淋巴結(jié)和脾臟冷凍組織中未檢測到內(nèi)源性生物素。1994年Cauli等發(fā)現(xiàn)人體唾液腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞存在內(nèi)源性生物素，1997年Rodriguezso—t。等發(fā)現(xiàn)甲醛固定、石蠟包埋的腎臟和肝臟組織中沒有內(nèi)源性生物染色，但該組織用o．01mol／LpH6．0 CB抗原修復(fù)后出現(xiàn)了內(nèi)源性生物素的干擾，表明熱修復(fù)可使甲醛固定和石蠟包埋所遮蓋（mask）的內(nèi)源性生物素重新暴露。國內(nèi)周小鴿等也已證實(shí)在人體幾乎所有的正常組織大量的腫瘤組織和動物組織中存在內(nèi)源性生物素，尤其是上皮性腫瘤zui明顯。

生物素是一種維生素，相對分子質(zhì)量為244．3，來自食物和腸道細(xì)菌合成，在人體內(nèi)主要存在于線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，它是多種羧化酶的輔酶，參與糖異生和脂肪酸合成反應(yīng)。因此，代謝旺盛的富含線粒體的細(xì)胞，如大多數(shù)上皮源性細(xì)胞，有較多的內(nèi)源性生物素顯現(xiàn)。由于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞含有豐富的線粒體，因此，腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)內(nèi)源性生物素陽性反應(yīng)（假陽性）。這些假陽性反應(yīng)極易被當(dāng)作特異性反應(yīng)看待，從而出現(xiàn)誤判。如果見到胞質(zhì)中有陽性的棕色顆粒，應(yīng)考慮到內(nèi)源性生物素的干擾，并應(yīng)進(jìn)一步確證。

消除內(nèi)源性生物素的zui有效、zui簡單的辦法就是不用ABC、S-P（LsAB）法，改用En—Vision等方法。另一種辦法就是在熱修復(fù)后，一抗前或一抗后用20％蛋清（20ml蛋清+gOml蒸餾水）于37℃封閉30min，效果非常理想。